貝賽爾特學習園地|陳朝熙:支原體檢測

支原體檢測

支原體(mycoplasma)屬于細菌域原核生物界硬壁菌門中低 c、G含量的革蘭陽性桿菌分支柔膜體綱(Mollicutes)，是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物 ，大小介于細菌與病毒之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態。在細胞培養過程中，支原體感染發生率達30％～60％，隨著細胞培養技術的廣泛應用，組織、細胞、疫苗等受支原體污染的現象越來越普遍。

污染細胞最常見的支原體包括：發醉支原體（M.fementans）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）、口腔支原體（ M.orale ）、精氨酸支原體（ M.arginina ）、梨支原體（M.pirum）、唾液支原體（M.salivarium）和人型支原體（M.hominis）。被這些支原體污染的細胞常常不引起明顯的細胞病變，也不導致培養液渾濁，難以憑肉眼發現，因此，建立一種高效、快速、敏感度高的檢測方法十分必要。

支原體的檢測方法有很多種，《中國藥典》中支原體檢測方法包括培養法、DNA熒光染色法，其他方法還有酶法、PCR法、ELISA法、間接免疫熒光試驗、生化檢測法、直接血凝試驗、探針法、放射自顯影法等。每種方法各有利弊，不同方法的支原體檢出率也有差別，一般在5％ ～87％之間。本次講述培養法、DNA熒光染色法、PCR法檢測。

1、培養法

方法：配制支原體培養基，取1 mL細胞培養液，接種于液體培養基中，37 ℃培養，同時觀察是否有混濁或pH值改變。2周后，分別取0.1 mL液體培養液涂在瓊脂平板上，倒置于37 ℃厭氧箱培養，至少3周，持續觀察是否有支原體菌落出現，有圓形無色透明菌落出現為陽性。

評價：此法是較早采用的方法。在固體瓊脂培養基、半固體或液體培養基上培養 Vero、NIH3T3 等易被支原體污染的細胞株，可在其中分離到支原體菌株。培養法得到支原體菌株是最可靠的陽性指標。該方法的缺點是靈敏度低，不能檢測到種屬且不適用于檢測所有支原體。

2、DNA熒光染色法

方法：

①制備標本。首先，在六孔板中制備蓋玻片細胞培養物，然后將待測細胞接種到蓋玻片上，用培養液培養 1 ～ 2 d。采用有支原體污染的細胞作陽性對照，無支原體污染的細胞作陰性對照。

②固定。首先，吸出培養液，用新鮮配制的 1∶3冰醋酸 /甲醇固定液固定 15 min；然后，吸出固定液后重復固定一次；最后，吸除固定液室溫下干燥。

③染色。用 pH值 7.2的 PBS稀釋Hoechst33258儲存液，使終濃度為 5μg/ml；然后將染液滴加到固定好的細胞上，室溫下避光染色 30 min。

④洗滌。用雙蒸水浸泡染色過的蓋玻片 3次，每次 3 ～ 5 min。⑤封片。滴加 1滴含 50%甘油的檸檬酸緩沖液( pH值 5.5)到染色過的細胞表面，然后將蓋玻片上有細胞的一面朝下，覆蓋在載玻片上。⑥觀察。在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光分布狀態，判斷有無支原體污染及污染程度。

評價：利用熒光燃料 Hoechst33258 能與DNA 特異性結合的性質，在熒光顯微鏡下觀察被支原體污染的細胞時，除細胞核外，在細胞膜上及細胞之間也有熒光顆粒。熒光染色法分為直接法和間接法兩類，直接法即用染色劑將待測細胞直接染色；間接法指在無污染指示細胞中加入待測細胞上清液，進行混合培養后再染色，因此間接法的靈敏度高于直接法。

3、PCR法

方法：采用酚氯法提取待測細胞DNA，引物為常見污染支原體種類16sRNA的保守區域序列，長度472 bp，引物A：5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’，引物B：5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’。PCR總反應體積為25 μL，加入PCR緩沖液、氯化鎂、Taq酶、dNTP、模板和引物。擴增條件為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性25 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s， 循環30次后，72 ℃恒溫7 min。取9 μl擴增產物與1 μl 10×Loading Buffer混合后，加入含0.5 μg/ml溴化乙錠的1.5％瓊脂糖凝膠，75V電泳25 min，用紫外檢測儀觀察并用凝膠成像系統照相，有目的片段出現為陽性。

評價：PCR 法是目前常用的支原體污染檢測方法，其原理是根據具有支原體種或屬特征的核酸序列（一般用 16S rRNA）設計引物，經預變性、擴增、延伸后得到擴增產物，進行瓊脂糖凝膠電泳實驗后，通過凝膠上條帶的位置進行判斷待測物是否感染了支原體。PCR 法靈敏度高，檢測時間短，操作簡便，但仍然存在一定缺陷：如易出現假陽性或假陰性等。近年來出現了兩步法 PCR 檢測支原體污染的方法，即在第一次 PCR 的基礎上，再進行第二次 PCR。其原理與 PCR 理相同，只是分別采用外引物 (outer p rimer) 和內引物 (inner primer) 分兩輪進行擴增，相對于傳統 PCR 法而言，其準確性、特異性和靈敏度均有所提高。

細胞制劑質控標準檢測項目至少包括內毒素檢測、無菌檢測、支原體檢測、細胞數量、細胞存活率、細胞表型等的檢測。支原體檢測在質檢中也具有很重要的地位。支原體感染細胞后一般難于清除，事實上，被支原體污染的細胞，即使污染被清除，細胞原有的生物學特性，如基因的表達、抗原性和代謝特點也隨之發生了相應的改變，會對研究結果造成嚴重影響。為了保證細胞體系免受污染的影響，關鍵是加強預防盡可能減少污染的發生，一般需要在培養液中加入抗生素；另外，清潔的實驗室環境和良好的操作習慣，優質的試劑，如血清、培養基等都是很重要的。