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近日， 美國血液學學會（ASH）會議公布了一份最新的研究成果摘要，賓夕法尼亞大學Dr. Milone研究團隊，宣布其可在短短24小時內產生功能性CD19特異性CAR-T細胞（CART19），此方法是5天、3天CAR-T制備技術上的又一更新。該研究團隊將于12月9日在ASH會議上公布更多的數據。
（ 圖片來源：ash.confex）
該研究的通信作者Dr. Michael Milone是賓夕法尼亞大學醫院和醫學院的病理學和檢驗醫學副教授。他于1999年從新澤西州的醫學和牙科大學獲得醫學博士學位；在賓夕法尼亞大學繼續接受內科，實驗室醫學和輸血醫學的研究生醫學培訓；在博士后研究期間繼續科學研究；是賓大的Carl June博士CAR-T項目的早起原研人員，這項工作導致了對B細胞白血病和淋巴瘤患者的人工抗原受體的開放式I期研究。
（圖片來源：med.upenn.edu）
Michael Milone, MD, PhD
Associate Professor of Pathology and Laboratory Medicine
14年前，Dr. Milone與貝賽爾特董事長兼首席科學家許中偉教授是Carl June團隊CAR-T項目最早的原研人員，他們研發的CTL-019最終成為了人類第一個被FDA批準的CAR-T藥物。許教授在參加“細胞治療國際研討會上”提道：“未來，CAR-T細胞制備的工藝極其重要。隨著細胞制備的周期不斷縮短，“24小時CAR”、甚至“vein-to-vein”CAR-T的產生，除了極大地降低了綜合成本，也將顛覆現有的生產模式和概念?！边@對于病情進展迅速的患者來說是至關重要的。
許中偉教授在“2019（第十屆）細胞治療國際研討會”上提出CAR-T生產“vein-to-vein”模式和概念。
許中偉教授與Michael Milone在北京大學未名湖畔合影。
許教授回國后，引薦Dr. Michael Milone成為“北京大學免疫系客座教授”兼“貝賽爾特公司特約顧問”，共同為細胞免疫治療行業助力
CAR-T細胞制造過程的流程圖（圖片來源：discovery.ucl.ac.uk）
在目前的細胞治療開發過程中，盡管CAR-T細胞的生產通過各種制造方法進行，但所有制造方法都包括相同的共同步驟。
首先，通過白細胞分離術分離患者的白細胞（WBC）并洗滌。然后，激活T細胞，用CAR轉基因轉導，擴增至所需的細胞數量用于治療，制劑生產和灌裝。在對患者進行質量控制測試和預備性淋巴清除化學療法后，將產品注射到患者體內。
（圖片來源：discovery.ucl.ac.uk）
白細胞分離術和細胞洗滌 T細胞療法開始于通過白細胞分離法獲得患者的WBC，這是一種將白細胞與全血分離的單采血液成分術。通常采用連續或者半連續的密度梯度離心方法。在分離過程中添加的抗凝劑，紅細胞和血小板在洗滌過程中會被清除?？鼓齽┰诨罨倪^程中能夠改變細胞的特征，紅細胞會影響產品的臨床效果，血小板會導致細胞的聚集。洗滌后，直接使用WBCs或者WBCs經程序降溫冷凍保存。
富集和細胞 一些研究人員使用CliniMACS系統對細胞進行富集和洗滌，其中相應的抗體與順磁珠連接。FredHutchinson Cancer研究中心和西雅圖兒童醫院為CD4＋（輔助性T細胞）和CD8+細胞（細胞毒T細胞）富集WBC，以便輸入具有確定的CD8+/CD4+細胞比例的產品。類似的，Brown等富集收集CD62L+細胞。MDAnderson癌癥中心發現NK細胞會阻礙T細胞的培養。當NK細胞超過10%時，使用CD56+磁珠可以去除NK細胞。拉莫斯等人在具有> 95％循環白血病細胞的兩名患者中進行CD3 +選擇，以使得能夠從含有低百分比的T細胞的單采血液成分產物中擴增。
活化 在體內，通過抗原呈遞細胞，例如樹突細胞（DC）刺激天然T細胞的增殖和分化。T細胞通過T細胞受體（TCR）與位于DC細胞表面的主要組織相容性復合物之間的相互作用以及通過共刺激分子（如CD28，4-1BB和OX40）激活。為了避免與DC共培養繁瑣的過程，已經開發并實施了幾種模擬T細胞天然刺激的方法。最基本的方法是加入OKT3（抗CD3單克隆抗體）和白細胞介素。
基因遞送 基因遞送可以分為病毒和非病毒的方法。在CAR-T細胞治療中，包括電轉DNA，轉座子系統以及病毒載體，尤其是慢病毒或逆轉錄病毒轉染。病毒轉導是最常見的基因遞送方法。
擴增 在目前的細胞培養過程中，通常增加培養基體積；通常通過增加袋子或燒瓶的尺寸或通過從板到燒瓶，燒瓶到靜態培養袋或靜態培養袋換成RM生物反應器。
目前，在所有CAR-T研究機構中，賓夕法尼亞大學接受了大多數的患者；細胞的靶點通常是CD19 ，起源產品主要是自體T細胞；大多數CAR-T細胞產品的制造時間在14天；CAR-T細胞療法主要用于治療血液系統惡性腫瘤。
圖表分析（ 圖片來源：discovery.ucl.ac.uk）
CAR-T細胞療法的療效取決于過繼轉移后T細胞的植入和持久性。植入和持久性的潛力與T細胞分化的狀態有關，賓大團隊此前已經證明減少離體培養的持續時間將限制T細胞分化并提高CAR-T細胞療法的療效。但是大多數實驗方案通常先通過TCR和共刺激受體的結合激活T細胞，然后將T細胞離體擴增9到14天，這對于CAR-T細胞療法的療效產生了一定的影響。
于近期發表在ASH年會上的研究摘要，賓大團隊描述了使用慢病毒載體可在一天內產生功能性CD19特異性CAR-T細胞（CART19），而無需事先激活T細胞。該摘要顯示了使用非優化過程，可以使用表達紅外紅色熒光蛋白（iRFP）的慢病毒載體轉導平均6.5％（范圍為2％-10％）的新鮮分離的靜態T細胞，與活化的T細胞轉導相比，表達動力學更慢（靜態和活化T細胞分別在96小時和48小時達到峰值）。盡管與活化的T細胞相比效率低得多，但在所有T細胞亞群中檢測，其中央記憶T細胞顯示出最大的轉導效率；與未處理的T細胞相比，平均轉導率高4倍。
賓大團隊證明了即使沒有逆轉錄或整合酶功能，CAR表達也可以在靜態的T細胞中發生，即所謂的“偽轉導”。重要的是，賓大團隊證明了該表達產生的CAR-T細胞具有溶細胞活性和效應細胞因子，對抗原的反應類似于激活和轉導的CAR-T細胞。
（ 圖片來源：ash.confex）
該研究團隊使用公認的急性淋巴母細胞白血病Nalm6模型進行試驗，發現由靜態T細胞轉導16小時后洗滌去除載體產生的CART19細胞表現出劑量依賴性的抗白血病活性，該活性只要注射小劑量即可持久2x10^5個T細胞。
利用慢病毒載體將基因轉移到靜態T細胞的能力，描述的高度簡化的制造方法具有增強治療效力的潛力，同時還大大降低了成本。此外，這種制造方法還可能擴大接受療法的患者數量。
文章來源：
1.https://ash.confex.com/ash/2019/webprogram/Paper131147.html 2.https://discovery.ucl.ac.uk/id/eprint/10050033/1/Veraitch_20180109_CAR%20T%20cell%20manufacturing%20Review%20-%20Revision.pdf 3.https://www.med.upenn.edu/cci/milonelab/
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